Pihak penegak hukum berusaha mendeteksi serangan bioterorisme, dokter mendiagnosis penyakit dan agensi perlindungan konsumen memeriksa keamanan produk. Kini mereka mungkin telah menemukan sekutu baru dengan adanya sebuah teknologi deteksi dari Lawrence Livermore National Laboratory (LLNL) . Teknologi ini, yang dikenal sebagai Lawrence Livermore Microbial Detection Array (LLMDA), bisa memungkinkan penegak hukum, profesional medis dan lain-lain bisa mendeteksi dalam waktu 24 jam jika sesuatu terkena virus atau bakteri yang telah diurutkan dan termasuk di antara daftar probe dari array tersebut.
Dikembangkan antara bulan Oktober 2007 dan Februari 2008, LLMDA mendeteksi virus dan bakteri dengan menggunakan 388.000 probe yang sesuai dengan pola kotak-kotak di tengah-tengah slide selebar satu inci, kaca sepanjang tiga inci. Versi operasional saat ini dari LLMDA berisi probe yang terdiri dari lebih dari 2.000 virus dan sekitar 900 bakteri. “Kemampuan untuk mendeteksi komponen bakteri dan virus utama dari setiap sampel dapat digunakan dengan berbagai cara yang tak terhitung jumlahnya,” kata Tom Slezak, kepala asosiasi program LLNL untuk Informatika. “Hal ini penting karena ini mengisi kesenjangan biaya-kinerja yang relevan dengan banyak pekerjaan: biodefense, kesehatan masyarakat dan keamanan produk.” Di bidang biodefense, sistem saat ini berpusat pada deteksi seperangkat prioritas yang lebih kecil dari patogen berisiko tinggi, bukan pengujian untuk spektrum yang lebih luas dari organisme.
Obat modern telah berhasil menggunakan teknologi baru, berdasarkan prestasi ilmiah,untuk mendiagnosa dan mengobati penyakit infeksi. Dalam beberapa tahun terakhir, metode mikrobiologi tradisional seperti mikroskop atau analisa mikrobiologi berbasis budaya telah dilengkapi dengan sistem baru, didasarkan pada teknologi genetika molekuler seperti:
1. reaksi rantai polymerase (PCR assay)
2. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ,dan
3. Equencing langsung,
Platform untuk deteksi cepat dan karakterisasi mikroba patogen yang kritis diperlukan untuk mencegah dan mengobati penyakit. Teknologi deteksi yang ada didasarkan pada amplifikasi sekuens asam nukleat. Meskipun metode ini mampu dengan cepat mengidentifikasi patogen yang dipilih pada spesies atau bahkan tingkat strain, mereka tidak dapat di-multiplexing untuk mendeteksi ratusan spesies secara bersamaan.Sebuah biologi molekular baru yang berbasis metode deteksi mikroba untuk identifikasi cepat multiple spesies bakteri dan virus dalam sampel yang sama telah dikembangkan oleh kelompok penelitian Lawrence Livermore National Laboratory. Lawrence Livermore mikroba Deteksi Array (LLMDA) mendeteksi bakteri dan virus dengan menggunakan probe terhadap rangkaian DNA genom dalam waktu 24 jam
LMDA adalah array oligonukleotida yang komprehensif ("DNA chip" atau "microarray DNA"), sebuah seri tersusun dari ribuan titik mikroskopis oligonukleotida DNA, masing-masing berisi urutan DNA spesifik ("probe"). LLMDA terdiri dari 388.000 probe dipasang ke satu inci oleh tiga inci slide kaca mikroskop yang dirancang untuk mendeteksi 900 bakteri dan 2.000 virus Setiap tes pemeriksaan untuk urutan tertentu DNA.
Proses deteksi melibatkan
Pemurnian DNA atau RNA dari sampel, seperti dahak atau darah RNA diperlakukan dengan reagen Trizol dan diendapkan dengan isopropanol, dicuci dengan etanol 70%, RNA pelet dikeringkan dan dilarutkan dengan air RNase gratis 1 ug RNA digunakan sebagai template untuk sintesis untai ganda cDNA menggunakan primer heksamer acak dan Superscript double-stranded cDNA Sintesis DNA dimurnikan atau cDNA disintesis diberi label menggunakan terjemahan nick dengan Cy3-label primer nanomer acak dan DNA polimerase Klenow selama 3 jam di 374 ug DNA atau cDNA dilabeli dengan pewarna fluorescent adalah hibrida ke microarray di stasiun hibridisasi Maui selama 16 jam pada 42 C
Sebuah scanner fluorescent (Akson GenePix 4000B scanner pada resolusi 5 mm) dan perangkat lunak analisis yang digunakan untuk mendeteksi probe, mengidentifikasi kehadiran urutan DNA virus atau bakteri.
Deteksi
Pilihan probe dalam array ini didasarkan pada data sequencing terbaru. Spesies probe khusus dipilih untuk semua segmen virus dan bakteri lengkap genom, sequencing, dan plasmid yang diselenggarakan oleh keluarga. Bakteri dan virus database termasuk urutan.
1. Genbank NCBI database, Microbial Genomics Terpadu (IMG) proyek (Joint Genome Institute
2. Komprehensif Sumber Daya mikroba (CMR) database dari JC Venter Institute, dan Institut Sanger (Inggris).
LLMDA array telah dirancang dengan kemampuan untuk lebih memodifikasi dan memperluas kemampuan fungsionalnya. LLMDA dapat berisi probe untuk patogen, penemuan deteksi, atau kombinasi keduanya. Pendekatan ini memungkinkan memilih strategi probe desain dan platform array. Yang paling penting, sebagai data urutan baru menjadi tersedia dari organisme yang baru ditemukan atau baru sequencing, LLMDA dapat diperbarui dengan probe untuk mendeteksi mereka. Jumlah besar oligonukleotida DNA array ini, bersama dengan strategi desain probe efisien, memungkinkan untuk mencakup semua sekuens lengkap genom bakteri dan virus dengan jumlah yang jauh lebih besar probe per sasaran daripada yang dilaporkan sebelumnya array.
Perbandingan dengan PCR dan Sequencing
Dalam hal kompleksitas, LLMDA adalah jalan tengah antara sequencing dan PCR, menawarkan kepadatan probe tinggi untuk deteksi target yang beragam dan mungkin tak terduga dan biaya rendah per sampel (bukan ratusan ribu dolar per tes) ,Tes PCR sangat cepat dan sensitif, tetapi memiliki kapasitas terbatas untuk menguji adanya beberapa organisme secara bersamaan. Kit PCR memungkinkan identifikasi satu patogen pada satu waktu sedangkan LLMDA dapat mendeteksi sejumlah virus dan bakteri ada dalam sampel sederhana dan kompleks dalam waktu 24 jam.
LLMDA terdeteksi strain berbeda dari virus syncytial manusia pernapasan (strain ATCC VR-26, S2) dan coronavirus manusia HKU1 (genotipe B, strain genotipe B N15, N21 strain genotipe C) pada sampel sputum klinis. Hasil dikonfirmasi dengan PCR. Hepadnaviridae (Hepatitis B virus) juga terdeteksi dalam sampel serum klinis oleh LLMDA. Dalam sampel kotoran klinis LLMDA terdeteksi untuk campuran dari kedua virus seperti strain berbeda parechovirus Manusia, virus Norwalk, dan virus ayam anemia, dan bakteri seperti strain berbeda dari Streptococcus, Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri), banyak yang berhubungan dengan kesulitan pencernaan. Semua data yang dikonfirmasi dengan analisis PCR.
Namun, beberapa organisme yang tidak mungkin hadir dalam sampel manusia juga terdeteksi. Organisme ini, ferrooxydans Mariprofundus (bakteri laut dalam yang dikumpulkan dekat Hawaii), calon divisi TM7 (dikumpulkan dari plakat subgingival di mulut manusia), dan gamma proteobacterium-laut (dikumpulkan di Samudra Pasifik pantai di kedalaman 10 m) yang terdeteksi, mungkin menunjukkan beberapa probe non-spesifik mengikat.
Hal ini juga meningkatkan kemungkinan bahwa LLMDA mungkin mengidentifikasi organisme baru Sebagai perbandingan, tes PCR yang baik untuk mendeteksi patogen terkenal urutan yang sudah dikenal, tetapi tidak cocok untuk penemuan spesies patogen novel atau untuk mendeteksi strain varian dari spesies yang diketahui. Dengan demikian LLMDA dapat digunakan tidak hanya untuk karakterisasi patogen dikenal tetapi juga mendeteksi organisme baru dengan homologi beberapa organisme sebelumnya sequencing.
Metode Sequencing seperti degradasi Edman atau sekuensing Sanger yang mahal dan memakan waktu. Genom mikroba yang sulit dan memakan waktu untuk mengkarakterisasi ketika mereka menunjukkan tidak ada kesamaan dengan urutan yang telah dikenal, sehingga metode sekuensing memiliki keterbatasan manfaat praktis untuk identifikasi genom novel.
Metode LLMDA juga memiliki kelemahan yang probe dirancang dari sekuens diketahui tidak mungkin untuk mendeteksi organisme yang benar-benar baru kurang homologi kepada mereka urutan. Dalam kasus di mana sampel mengandung organisme yang belum diurutkan atau urutan yang tidak ada dalam database analisis saat ini, tetapi cukup mirip dengan mikroba sequencing lain, analisis akan mengidentifikasi beberapa organisme yang terkait paling mirip dengan yang ada di sampel. Dengan demikian array ini dapat digunakan untuk memandu pemilihan subset sampel untuk analisis lebih lanjut oleh sekuensing
Aplikasi
LLMDA sangat berguna dalam diagnosa medis dari penyakit menular. Tes ini dapat diterapkan pada sampel klinis ketika diagnosa PCR tidak cukup informatif. Cukup sering bahwa penyebab infeksi tidak diketahui, membuat keputusan apakah sulit untuk merawat pasien dengan antibiotik, obat antivirus, atau terapi lainnya. Dalam kasus patogen titer cukup tinggi, assay yang dapat mendeteksi patogen dalam waktu 2 jam. LLMDA dapat membantu dalam mengungkap co-infeksi dengan lebih dari satu organisme.
Uji ini juga dapat digunakan untuk memeriksa saham terisolasi dan vaksin untuk kontaminan. LLMDA berhasil terdeteksi PCV1 DNA virus (strain virus babi) dalam vaksin Rotarix GlaxoSmithKline yang dirancang untuk melindungi bayi terhadap penyebab utama diare. Penggunaan teknologi microarray untuk mendeteksi kontaminasi virus dapat mendeteksi virus lebih luas daripada metode PCR saat ini digunakan. PCR lebih sensitif dibandingkan mikroarray saat skrining untuk virus tertentu, tetapi titer rendah virus mencemari potensi membatasi penggunaan untuk sejumlah kecil virus yang dicurigai. Penggunaan tes microarray Oleh karena itu tampaknya menjadi pilihan yang lebih aman untuk pengawasan produk yang berasal dari kultur sel, kolam plasma, atau sumber biologi lainnya dan yang mungkin berisi dan menularkan virus [9].
LLMDA akan menemukan aplikasi dalam makanan dan keamanan produk. Produk peraturan keamanan membutuhkan pengujian untuk spesifik kontaminan diketahui potensi biologis, namun pengujian LLMDA dapat menawarkan deteksi mikroba kontaminan yang hadir dalam jumlah yang cukup besar untuk secara potensial berbahaya daripada hanya mengecek bahwa tidak satupun dari kontaminan yang terdaftar hadir. Array juga mungkin berguna untuk mendeteksi keanekaragaman organisme dalam sampel lingkungan kompleks (misalnya di contoh tanah untuk menentukan keanekaragaman jenis mikroorganisme) [10].
Dikembangkan antara bulan Oktober 2007 dan Februari 2008, LLMDA mendeteksi virus dan bakteri dengan menggunakan 388.000 probe yang sesuai dengan pola kotak-kotak di tengah-tengah slide selebar satu inci, kaca sepanjang tiga inci. Versi operasional saat ini dari LLMDA berisi probe yang terdiri dari lebih dari 2.000 virus dan sekitar 900 bakteri. “Kemampuan untuk mendeteksi komponen bakteri dan virus utama dari setiap sampel dapat digunakan dengan berbagai cara yang tak terhitung jumlahnya,” kata Tom Slezak, kepala asosiasi program LLNL untuk Informatika. “Hal ini penting karena ini mengisi kesenjangan biaya-kinerja yang relevan dengan banyak pekerjaan: biodefense, kesehatan masyarakat dan keamanan produk.” Di bidang biodefense, sistem saat ini berpusat pada deteksi seperangkat prioritas yang lebih kecil dari patogen berisiko tinggi, bukan pengujian untuk spektrum yang lebih luas dari organisme.
Obat modern telah berhasil menggunakan teknologi baru, berdasarkan prestasi ilmiah,untuk mendiagnosa dan mengobati penyakit infeksi. Dalam beberapa tahun terakhir, metode mikrobiologi tradisional seperti mikroskop atau analisa mikrobiologi berbasis budaya telah dilengkapi dengan sistem baru, didasarkan pada teknologi genetika molekuler seperti:
1. reaksi rantai polymerase (PCR assay)
2. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ,dan
3. Equencing langsung,
Platform untuk deteksi cepat dan karakterisasi mikroba patogen yang kritis diperlukan untuk mencegah dan mengobati penyakit. Teknologi deteksi yang ada didasarkan pada amplifikasi sekuens asam nukleat. Meskipun metode ini mampu dengan cepat mengidentifikasi patogen yang dipilih pada spesies atau bahkan tingkat strain, mereka tidak dapat di-multiplexing untuk mendeteksi ratusan spesies secara bersamaan.Sebuah biologi molekular baru yang berbasis metode deteksi mikroba untuk identifikasi cepat multiple spesies bakteri dan virus dalam sampel yang sama telah dikembangkan oleh kelompok penelitian Lawrence Livermore National Laboratory. Lawrence Livermore mikroba Deteksi Array (LLMDA) mendeteksi bakteri dan virus dengan menggunakan probe terhadap rangkaian DNA genom dalam waktu 24 jam
LMDA adalah array oligonukleotida yang komprehensif ("DNA chip" atau "microarray DNA"), sebuah seri tersusun dari ribuan titik mikroskopis oligonukleotida DNA, masing-masing berisi urutan DNA spesifik ("probe"). LLMDA terdiri dari 388.000 probe dipasang ke satu inci oleh tiga inci slide kaca mikroskop yang dirancang untuk mendeteksi 900 bakteri dan 2.000 virus Setiap tes pemeriksaan untuk urutan tertentu DNA.
Proses deteksi melibatkan
Pemurnian DNA atau RNA dari sampel, seperti dahak atau darah RNA diperlakukan dengan reagen Trizol dan diendapkan dengan isopropanol, dicuci dengan etanol 70%, RNA pelet dikeringkan dan dilarutkan dengan air RNase gratis 1 ug RNA digunakan sebagai template untuk sintesis untai ganda cDNA menggunakan primer heksamer acak dan Superscript double-stranded cDNA Sintesis DNA dimurnikan atau cDNA disintesis diberi label menggunakan terjemahan nick dengan Cy3-label primer nanomer acak dan DNA polimerase Klenow selama 3 jam di 374 ug DNA atau cDNA dilabeli dengan pewarna fluorescent adalah hibrida ke microarray di stasiun hibridisasi Maui selama 16 jam pada 42 C
Sebuah scanner fluorescent (Akson GenePix 4000B scanner pada resolusi 5 mm) dan perangkat lunak analisis yang digunakan untuk mendeteksi probe, mengidentifikasi kehadiran urutan DNA virus atau bakteri.
Deteksi
Pilihan probe dalam array ini didasarkan pada data sequencing terbaru. Spesies probe khusus dipilih untuk semua segmen virus dan bakteri lengkap genom, sequencing, dan plasmid yang diselenggarakan oleh keluarga. Bakteri dan virus database termasuk urutan.
1. Genbank NCBI database, Microbial Genomics Terpadu (IMG) proyek (Joint Genome Institute
2. Komprehensif Sumber Daya mikroba (CMR) database dari JC Venter Institute, dan Institut Sanger (Inggris).
LLMDA array telah dirancang dengan kemampuan untuk lebih memodifikasi dan memperluas kemampuan fungsionalnya. LLMDA dapat berisi probe untuk patogen, penemuan deteksi, atau kombinasi keduanya. Pendekatan ini memungkinkan memilih strategi probe desain dan platform array. Yang paling penting, sebagai data urutan baru menjadi tersedia dari organisme yang baru ditemukan atau baru sequencing, LLMDA dapat diperbarui dengan probe untuk mendeteksi mereka. Jumlah besar oligonukleotida DNA array ini, bersama dengan strategi desain probe efisien, memungkinkan untuk mencakup semua sekuens lengkap genom bakteri dan virus dengan jumlah yang jauh lebih besar probe per sasaran daripada yang dilaporkan sebelumnya array.
Perbandingan dengan PCR dan Sequencing
Dalam hal kompleksitas, LLMDA adalah jalan tengah antara sequencing dan PCR, menawarkan kepadatan probe tinggi untuk deteksi target yang beragam dan mungkin tak terduga dan biaya rendah per sampel (bukan ratusan ribu dolar per tes) ,Tes PCR sangat cepat dan sensitif, tetapi memiliki kapasitas terbatas untuk menguji adanya beberapa organisme secara bersamaan. Kit PCR memungkinkan identifikasi satu patogen pada satu waktu sedangkan LLMDA dapat mendeteksi sejumlah virus dan bakteri ada dalam sampel sederhana dan kompleks dalam waktu 24 jam.
LLMDA terdeteksi strain berbeda dari virus syncytial manusia pernapasan (strain ATCC VR-26, S2) dan coronavirus manusia HKU1 (genotipe B, strain genotipe B N15, N21 strain genotipe C) pada sampel sputum klinis. Hasil dikonfirmasi dengan PCR. Hepadnaviridae (Hepatitis B virus) juga terdeteksi dalam sampel serum klinis oleh LLMDA. Dalam sampel kotoran klinis LLMDA terdeteksi untuk campuran dari kedua virus seperti strain berbeda parechovirus Manusia, virus Norwalk, dan virus ayam anemia, dan bakteri seperti strain berbeda dari Streptococcus, Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri), banyak yang berhubungan dengan kesulitan pencernaan. Semua data yang dikonfirmasi dengan analisis PCR.
Namun, beberapa organisme yang tidak mungkin hadir dalam sampel manusia juga terdeteksi. Organisme ini, ferrooxydans Mariprofundus (bakteri laut dalam yang dikumpulkan dekat Hawaii), calon divisi TM7 (dikumpulkan dari plakat subgingival di mulut manusia), dan gamma proteobacterium-laut (dikumpulkan di Samudra Pasifik pantai di kedalaman 10 m) yang terdeteksi, mungkin menunjukkan beberapa probe non-spesifik mengikat.
Hal ini juga meningkatkan kemungkinan bahwa LLMDA mungkin mengidentifikasi organisme baru Sebagai perbandingan, tes PCR yang baik untuk mendeteksi patogen terkenal urutan yang sudah dikenal, tetapi tidak cocok untuk penemuan spesies patogen novel atau untuk mendeteksi strain varian dari spesies yang diketahui. Dengan demikian LLMDA dapat digunakan tidak hanya untuk karakterisasi patogen dikenal tetapi juga mendeteksi organisme baru dengan homologi beberapa organisme sebelumnya sequencing.
Metode Sequencing seperti degradasi Edman atau sekuensing Sanger yang mahal dan memakan waktu. Genom mikroba yang sulit dan memakan waktu untuk mengkarakterisasi ketika mereka menunjukkan tidak ada kesamaan dengan urutan yang telah dikenal, sehingga metode sekuensing memiliki keterbatasan manfaat praktis untuk identifikasi genom novel.
Metode LLMDA juga memiliki kelemahan yang probe dirancang dari sekuens diketahui tidak mungkin untuk mendeteksi organisme yang benar-benar baru kurang homologi kepada mereka urutan. Dalam kasus di mana sampel mengandung organisme yang belum diurutkan atau urutan yang tidak ada dalam database analisis saat ini, tetapi cukup mirip dengan mikroba sequencing lain, analisis akan mengidentifikasi beberapa organisme yang terkait paling mirip dengan yang ada di sampel. Dengan demikian array ini dapat digunakan untuk memandu pemilihan subset sampel untuk analisis lebih lanjut oleh sekuensing
Aplikasi
LLMDA sangat berguna dalam diagnosa medis dari penyakit menular. Tes ini dapat diterapkan pada sampel klinis ketika diagnosa PCR tidak cukup informatif. Cukup sering bahwa penyebab infeksi tidak diketahui, membuat keputusan apakah sulit untuk merawat pasien dengan antibiotik, obat antivirus, atau terapi lainnya. Dalam kasus patogen titer cukup tinggi, assay yang dapat mendeteksi patogen dalam waktu 2 jam. LLMDA dapat membantu dalam mengungkap co-infeksi dengan lebih dari satu organisme.
Uji ini juga dapat digunakan untuk memeriksa saham terisolasi dan vaksin untuk kontaminan. LLMDA berhasil terdeteksi PCV1 DNA virus (strain virus babi) dalam vaksin Rotarix GlaxoSmithKline yang dirancang untuk melindungi bayi terhadap penyebab utama diare. Penggunaan teknologi microarray untuk mendeteksi kontaminasi virus dapat mendeteksi virus lebih luas daripada metode PCR saat ini digunakan. PCR lebih sensitif dibandingkan mikroarray saat skrining untuk virus tertentu, tetapi titer rendah virus mencemari potensi membatasi penggunaan untuk sejumlah kecil virus yang dicurigai. Penggunaan tes microarray Oleh karena itu tampaknya menjadi pilihan yang lebih aman untuk pengawasan produk yang berasal dari kultur sel, kolam plasma, atau sumber biologi lainnya dan yang mungkin berisi dan menularkan virus [9].
LLMDA akan menemukan aplikasi dalam makanan dan keamanan produk. Produk peraturan keamanan membutuhkan pengujian untuk spesifik kontaminan diketahui potensi biologis, namun pengujian LLMDA dapat menawarkan deteksi mikroba kontaminan yang hadir dalam jumlah yang cukup besar untuk secara potensial berbahaya daripada hanya mengecek bahwa tidak satupun dari kontaminan yang terdaftar hadir. Array juga mungkin berguna untuk mendeteksi keanekaragaman organisme dalam sampel lingkungan kompleks (misalnya di contoh tanah untuk menentukan keanekaragaman jenis mikroorganisme) [10].